中山大学曾园山教授团队最新研究发现天然生物活性材料-去细胞视神经作为组织工程类脊髓白质组织（类白质）支架的独特优势，并解析了类白质成功构建的机制。应用去细胞视神经构建的类白质有效地解决了脊髓白质损伤修复所面临的如何同时促进再生轴突直行生长和髓鞘化的难题，使得动物肢体精细运动和感觉功能得到明显改善。
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研究内容简介
脊髓损伤后在损伤处形成不利于神经再生的微环境，神经元轴突(神经纤维)的内在再生能力受限；持续存在的炎症反应最终导致损伤处形成胶质和纤维瘢痕，发展为难于逆转的感觉和运动功能障碍。重塑脊髓神经再生微环境，促进轴突及其髓鞘再生，最终重建脊髓神经环路是攻克脊髓损伤修复难题的关键。
近十几年来国内外研究发现，单纯细胞移植很难实现干细胞在脊髓复杂损伤微环境中定向分化为功能细胞。应用组织工程策略的优势在于可以根据脊髓修复的具体需求，设计支架材料、种子细胞和生物活性因子的最优组合，以应对如何重塑神经再生微环境和修复脊髓神经环路的关键科学问题。
曾园山教授团队长期致力于应用干细胞和组织工程策略修复受损伤脊髓的神经环路，对作为组织工程要素之一的生物支架材料实施持续研发。在脊髓损伤后再生的轴突如果缺乏髓鞘包绕，其传导信息的功能将受到极大的影响。为了更高效率地修复受损伤脊髓的神经环路，基于促进脊髓白质轴突直行生长及形成髓鞘的需求，他们采取了合成生物学理念和组织工程新技术，设计构建了类脊髓白质。
类脊髓白质的构建遵从了组织器官发育的主要原理，不同于传统意义的类器官，属于工程化的类神经组织。其构建综合了天然生物活性支架、种子细胞、神经营养因子和培养时间，这4个重要因素的相互作用。其中，天然生物活性支架的选择是关键因素[图1]。研究表明，相对于胶原、明胶、壳聚糖等单一成分的生物材料，神经组织（如坐骨神经或者脊髓组织）在去细胞后的细胞外基质蛋白能为神经元轴突提供更多促进其生长信号。支架成分越接近脊髓的细胞外基质，越有利于为受损伤脊髓提供促进轴突生长及形成髓鞘的微环境。
图1：去细胞视神经的制备及检测。A，去细胞视神经制备的示意图。B-H，形态学检测和结构分析，可见去细胞视神经具有分布均匀的直行通道和通道壁的微米级横向小孔。I-M,去细胞视神经通道表面含丰富的层黏连蛋白（LN），能够支持神经干细胞更好地存活。N-U,去细胞视神经能够更好地支持DRG神经元突起直行再生和髓鞘形成。
在脊髓白质损伤处移植天然生物活性支架引导再生轴突的直行生长显得非常重要。虽然可注射凝胶材料或者纳米微球材料可以达到填补脊髓空洞和促进轴突生长的效果，但对于较大缺损范围的损伤，更需要支架材料具备能够引导轴突直行再生的特性。本研究结果证实了去细胞视神经作为类白质构建支架的独特优势。优势之一在于去细胞视神经的微拓扑物理结构，即均匀分布的直行通道和微米级横向小孔，特别适宜再生轴突的直行生长及其侧支出芽，营造了少突胶质细胞在通道间迁移和信息交流的空间微环境。优势之二在于去细胞视神经独特的细胞外基质能够为少突胶质细胞谱系的定植、分化和功能成熟，提供更适宜的微环境。蛋白质组学检测结果和少突胶质细胞谱系单细胞测序的分析[图2]证实了去细胞视神经诱导少突胶质细胞谱系发育和功能成熟的重要机制。
图2:少突胶质细胞谱系单细胞测序。在少突胶质细胞谱系发育过程中，去细胞视神经中所含的各种亚型的层黏连蛋白能够和少突胶质细胞谱系发育过程中所表达的各型受体相结合，从而促进少突胶质细胞谱系的发育、分化和功能成熟。
去细胞视神经构建的类白质移植到大鼠的胸段（T10）半横切背侧脊髓损伤处最终实现了与宿主脊髓白质的良好整合，使再生轴突得以直行生长和髓鞘化，有效地解决了脊髓白质损伤修复所面临的如何同时促进再生轴突直行生长和髓鞘化的难题，从而促使肢体精细运动和感觉功能得到明显的改善[图3–图5]。类白质移植修复脊髓白质损伤的主要机制在于其为再生轴突提供了物理引导、细胞外基质、髓鞘形成细胞和神经营养因子[图3，图5]。有趣的是，去细胞视神经中富含的层黏连蛋白能够与少突胶质细胞所分泌的神经营养素-3亲和结合，营造了局部富集神经营养素-3的微环境，更好地维持促神经再生和髓鞘化的独特生态位(ecologicalniche)[图3，图5]。
图3：类白质的构建思路。去细胞视神经通道表面的LN能够通过与少突胶质细胞表面表达的整合素（ITGA/ITGB）特异性结合，促进少突胶质前体细胞定植和进一步分化成熟并在类白质内部形成具有独特微环境的生态位(ecologicalniche)。
图4：类白质移植到大鼠半横切背侧脊髓损伤处，有利于促进瘫痪后肢的精细运动和感觉功能的恢复。能够更好地促进移植区神经元轴突的直行再生和髓鞘形成。
图5：去细胞视神经通道表面的LN能够和少突胶质细胞所分泌的NT-3亲和结合，营造局部富集NT-3的微环境。LN还能够通过与再生轴突表面的ITGA通过配体和受体结合的方式引导轴突直行生长。
本研究为高效修复脊髓白质损伤提供了组织工程新策略。将来可以在人源化基因编辑猪来源的去细胞视神经支架上种植病人自体iPSC源性神经干细胞，构建用于临床脊髓损伤修复的类脊髓组织。未来的研究中，也可以采取组织工程设计的策略将去细胞视神经负载其他类型的功能性种子细胞，或者将去细胞视神经功能改性构建组织工程化的类组织或者类器官，使之满足体外病理和药物研究模型的需求或者满足体内移植修复受损伤组织的需求。
02
论文第一/通讯作者简介
第一作者兼共同通讯作者：赖碧琴
医学博士,中山大学中山医学院，特聘研究员，广东省自然科学杰出青年基金获得者，入选中国科协青年人才托举工程。从事干细胞与组织工程技术修复脊髓损伤的研究，创新性地构建了国际首例可用于移植修复脊髓损伤的组织器官型类脊髓组织。发表第一/通讯作者论文10篇，其中影响因子大于10论文6篇。主持国家重点研发项目子课题在内的国家级课题3项。
共同第一作者：白瑜蓉
干细胞与组织工程专业，在读博士研究生，研究方向为干细胞组织工程与神经再生修复，发表第一作者论文2篇。
通讯作者：曾园山
医学博士、教授、博士生导师。年开始从事组织学与胚胎学专业，年攻读中山医学院硕士研究生，在华西医科大学(现四川大学)攻读博士研究生，在美国印第安纳州大学医学院做博士后研究。回国后开展基因修饰细胞移植与脊髓损伤修复机制研究。在香港大学医学院做访问学者，研究成体干细胞的分化。聘任为中山大学中山医学院组织胚胎学教研室教授、中山大学脊髓损伤研究所副所长、干细胞与组织工程教育部重点实验室副主任、广东省脑功能与脑疾病重点实验室副主任、江苏省神经再生协同创新中心学术带头人、解剖学研究杂志副主编。现研究方向是：1.组织工程神经元中继器构建修复脊髓损伤；2.神经调控技术联合干细胞移植修复脊髓损伤。获得国家自然科学基金委11项目(其中有重大项目课题、重点项目、联合基金项目、海外学者合作项目、面上项目)和国家重点研发计划项目等资助。至今为止，在国际学术期刊上发表学术论文70余篇，其中发表在有影响力的期刊AdvancedScience、AdvancedFunctionalMaterials、Biomaterials、StemCellReports和JournalofNeuroscience等。曾获广东省自然科学奖二等奖和卫生部科技进步奖三等奖。获国家发明专利授权4项和国家实用新型专利授权3项。获国务院特殊津贴专家、南粤优秀教师奖和宝钢优秀教师奖等荣誉。
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