文献分享
今天为大家分享一篇发表在ColloidsandSurfacesB:Biointerfaces上的文章，题目是“Promoting3Dneuronaldifferentiationinhydrogelforspinalcordregeneration”。在本研究中，研究人员提出了一种将BMSCs和NSCs负载到3DGelMA水凝胶中形成一种功能支架。将装载BMSCs和NSCs的功能性水凝胶支架植入大鼠脊髓半切部位，可显著促进运动功能恢复和神经元分化，减少胶质瘢痕、纤维化瘢痕和炎症反应。该功能支架在促进轴突再生方面具有巨大的治疗潜力。
C24.,0.,23.,1.,22.,2.z"fill="rgb(,,)">背景介绍
脊髓损伤(Spinalcordinjury,SCI)通常是由直接或间接的外部因素引起的脊髓结构和功能的损伤，最终导致损伤节段以下的感觉和运动功能的永久性损伤。脊髓的自身再生能力差，损伤后出现的囊肿、胶质瘢痕、抑制分子和炎症反应进一步抑制了其再生。
干细胞移植技术为脊髓损伤修复提供了一种有前景的治疗策略。神经干细胞(NSCs)是一种多能干细胞，具有向神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞分化的能力。骨髓间充质干细胞（BMSCs）不仅能抑制瘢痕组织和囊肿的形成，还能促进M1巨噬细胞向M2巨噬细胞的转化。该过程减少了急性期的炎症反应，促进了脊髓损伤的修复。同时研究表明，骨髓间充质干细胞可以促进NSCs向神经元的分化。
GelMA水凝胶是由加工过的天然细胞外基质(ECM)组成的光敏水凝胶，由于三维GelMA水凝胶的结构特点，其对氧和营养物质具有较高的渗透性，同时GelMA水凝胶还能促进细胞的存活、增殖和迁移。
研究思路
在本研究中，研究人员通过调节水凝胶浓度来模拟脊髓的结构和力学性能。
对骨髓间充质干细胞和神经干细胞进行光囊化处理，促进神经干细胞向神经元分化，同时减少星形胶质细胞的形成。
在体内，将携带BMSCs和NSCs的三维水凝胶支架植入大鼠脊髓半切模型，在8周内评估神经再生能力。
C24.,0.,23.,1.,22.,2.z"fill="rgb(,,)">实验结果
1.凝胶水凝胶的表征
在本研究中，研究人员对骨髓间充质干细胞和神经干细胞封装于两种不同浓度的3DGelMA水凝胶，具体为5%(软)和10%(硬)(图1A,G)。
5%(软)和10%(硬)软水凝胶都具有多孔结构，为被包裹的细胞与其外部环境之间的物质交换提供了足够的空间(图1B-C)。5%GelMA水凝胶的平均孔径为±13.76μm，大于10%GelMA水凝胶的平均孔径(±14.57μm,p0.05，图1D)。
在实验过程中（12h），5%GelMA水凝胶支架的保水能力始终高于10%GelMA水凝胶支架(图1F)。
对两种不同浓度的GelMA水凝胶进行压缩测试，发现10%水凝胶的杨氏模量明显大于5%水凝胶的杨氏模量(图1G)。5%GelMA水凝胶的水接触角(平均为29°)明显小于10%GelMA水凝胶的水接触角(平均为34°)，说明前者的润湿性更强（图1H）。
2.水凝胶中的活/死染色和细胞增殖
用live/Dead染色法检测活细胞百分率。如图1I-J所示，大多数细胞存活于两种杨氏模量不同的水凝胶中。第7天的活/死染色表明，在两种浓度的水凝胶中死亡细胞较少，但硬水凝胶中的死亡细胞数多于软水凝胶(图1K)。
为了确定不同杨氏模量的GelMA水凝胶对共培养细胞增殖的影响，采用CCK8法进行表征，结果如图1L所示。在实验过程中，共培养的细胞数量继续增加，培养7d后，软水凝胶中的细胞活力较好，细胞增殖明显高于硬水凝胶中的细胞。
图1GelMA水凝胶的表征。(A)GelMA水凝胶交联示意图。(B-C)SEM图像。(D)平均孔隙。(E)GelMA水凝胶的外观。(F)保水性。(G)压缩杨氏模量。(H)水接触角。(I,J)GelMA水凝胶与细胞共培养共聚焦图像。(K)光密度的定量比较。(L)CCK8法测定共培养细胞增殖。
3.骨髓间充质干细胞和水凝胶模量对NSCs分化的影响
本研究采用免疫荧光法对包封后的NSCs和BMSCs进行分析。Tuj-1和GFAP分别作为神经元分化和星形细胞分化的标志物。结果显示，硬水凝胶培养的细胞中Tuj-1水平明显低于软水凝胶培养的细胞(图2A,C)。与5%水凝胶包埋的细胞相比，在10%水凝胶包埋的细胞中GFAP表达明显增高(图2B,D)。
图2：水凝胶负载细胞在体外促进神经元分化和减少星形细胞的形成。(A,C)tuj-1阳性神经元及两种不同浓度水凝胶的光密度定量分析。(B,D)gfap阳性星形胶质细胞及两种不同浓度水凝胶的光密度定量分析。
4.减少损伤空穴体积和促进运动能力恢复
为了解术后损伤部位的完整性及病变体积，于术后8周进行HE染色。六组中，对照组组织病变体积大，结构紊乱。相比之下，共移植组不仅损伤部位空穴减少，组织完整性改善，再生组织呈有序线性结构，而且吻侧和尾侧组织完整性改善(图3A-F)。SCI组为82.42±1.59%，GelMA组为57.66±1.44%，GelMA/BMSCs组为41.68±1.59%，GelMA/NSCs组为37.7±1.92%，GelMA/BMSCs+NSCs组为30.96±1.02%(图4G)。
细胞支架修复脊髓损伤的能力可以通过后肢功能的恢复来评估。在手术8周内，使用BBB评分评估后肢运动功能(图3H)。从第4周开始，负载NSCs和BMSCs的水凝胶支架BBB评分较其他组明显改善。术后8周，共移植组评分为15.8±1.89，显著高于其他各组(p0.05)。
图3(A-F)HE染色进行组织学分析。(G)各组的腔体积以病变腔体积的百分比计算。(H)采用BBB评分法评价大鼠后肢运动。
5.调节炎症反应
研究人员通过CD68染色检测小胶质细胞/巨噬细胞来评估脊髓半切后8周的炎症反应(图4A-B)。免疫荧光结果显示，与SCI组和GelMA组相比，GelMA/BMSCs、GelMA/NSCs、GelMA/BMSCs+NSCs组均对cd68阳性细胞有较好的抑制效果(图4)。在这些组中，GelMA/BMSCs+NSCs治疗效果最优，与其他组相比，该组病变部位cd68阳性细胞数量明显减少。
图4：(A)脊髓损伤8周后小胶质细胞/巨噬细胞的CD68免疫荧光染色。(B)各组CD68光密度的定量比较。
6.促进神经元和少突胶质细胞再生，抑制胶质瘢痕和纤维化瘢痕
Tuj-1免疫荧光染色显示，Tuj-1在各组损伤部位均广泛分布，而GelMA/BMSCs+NSCs组半切损伤部位新生神经元较多(图5A)。与GelMA/BMSCs+NSCs组相比，GelMA/BMSCs组和GelMA/NSCs组tuj-1阳性神经元数量明显减少，而SCI组和GelMA组损伤部位tuj-1阳性神经元数量基本相同(p0.01)(图5B)。
图5：(A)损伤后8周Tuj-1(绿色)和GFAP(红色)免疫荧光染色。(B)Tuj-1光密度的定量分析。
MBP是少突细胞相关疾病的标志物。MBP免疫荧光染色显示，MBP阳性少突胶质细胞的结果与Tuj-1染色获得的结果相似(图6A,B)，GelMA/BMSCs+NSCs组信号密度最高。
星形胶质细胞和CSPGs分别用GFAP和CS-56标记。研究结果显示，与其他组相比，GelMA/BMSCs+NSCs组星形胶质细胞增殖和胶质瘢痕形成显著减少(图6A、C和图7A-B)。当两种细胞类型同时移植时，与单独使用BMSCs和NSCs相比，GelMA/BMSCs+NSCs组显示出减少了层蛋白阳性纤维化瘢痕形成(图7A,C)。装载BMSCs和NSCs的三维水凝胶支架能有效抑制抑制分子的沉积，减少瘢痕组织的形成，促进损伤部位神经与宿主组织的连接和整合。
图6(A)术后8周MBP阳性少突胶质细胞(绿色)和GFAP阳性星形胶质细胞(红色)。(B)组间MBP、GFAP光密度定量分析。
图7：(A)损伤后8周CS-56(红色)和层粘连蛋白(绿色)免疫荧光染色。(B-C)组间CS-56、层粘连蛋白光密度的定量分析
C24.,0.,23.,1.,22.,2.z"fill="rgb(,,)">结论
本研究基于脊髓复杂的解剖结构和力学特性，构建了负载NSCs和BMSCs的三维水凝胶支架，用于脊髓损伤修复。此外，采用光交联水凝胶技术可获得高含水率、力学性能不同的三维水凝胶支架。体外实验表明，三维水凝胶支架承载共移植细胞，能够促进细胞的存活、增殖和分化。骨髓间充质干细胞和水凝胶能促进NSC向神经元分化，减少星形胶质细胞的生成。体内实验表明，负载共培养细胞的三维水凝胶支架可促进神经元和少突胶质细胞的生成，抑制胶质瘢痕和纤维化瘢痕的形成。同时，脊髓损伤大鼠的运动功能也得到改善，炎症和空泡化得到抑制。因此，将装载BMSCs和NSCs的三维水凝胶支架植入损伤部位是研究脊髓损伤修复潜力的一种很有前景的方法。
END
原文链接：
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撰稿人
刘佳尚
校稿
刘佳尚
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